ドットブロットハイブリダイゼーションを用いたキクわい化ウイロイドの検定

ドットブロットハイブリダイゼーションを用いたキクわい化ウイロイドの検定

タイトルドットブロットハイブリダイゼーションを用いたキクわい化ウイロイドの検定
要約キクわい化ウイロイド(CSVd)の遺伝子をクローニングし、そのクローンを鋳型としPCRでDIG標識DNAプローブを合成する。このプローブを使いドットブロットハイブリダイゼーションでCSVdを検定すると迅速、高感度に検出することができる。
担当機関兵庫県立中央農業技術センター 生物工学研究所
連絡先0790-47-1117
区分(部会名)中国農業
専門バイテク
研究対象花き類
分類普及
背景・ねらい 兵庫県では、逆転写-遺伝子増幅法(RT-PCR)を用いたキクわい化ウイロイドの検定方法を確立し、迅速で確実な検定法として普及員に指導し、農家のキクの検定に利用している。さらに、安価でより迅速な検定法として、DIG(ディゴキシゲニン)標識DNAプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションによる検定法を確立する。
成果の内容・特徴
  1. CSVd遺伝子をRT-PCRで増幅し、pUC119のSmaⅠサイトにクローニングし、これを鋳型にPCRでDIG標識プローブを作製する(図1)。
     プライマーの配列:相補型;GCCCCAGCCGCGATCTCGTC、相同型;GACAGGAGTAATCCTAAAC
  2. キク葉0.05gを緩衝液(0.5M NaCl、0.1M Tris-HCl、0.5%SDS、0.25%
    DIECA)で磨砕し、0.5mlのフェノール/クロロフォルムを加えRNAを抽出し、エタノール沈殿する。沈殿を乾燥後20μlの蒸留水に懸濁する。その2μlを変性してナイロン膜にスポット後、風乾する。ナイロン膜を120℃で30分間ベーキングした後、薄手のプラスチック容器に入れ、100℃で2分間変性したDIG標識プローブとハイブリダイゼーションする。酵素標識抗DIG体を結合させ、基質、発色剤を反応させて青紫色の発色を確認する。
  3. CSVd接種株は青紫のスポットを示すが、無接種株はスポットができない(図2)。接種試料を段階希釈し、検定すると100倍から1,000倍の希釈でも陽性反応が確認できる(図3)。
  4. 検定の精度は生物検定やRT-PCRと比べ同程度で、検定期間が1.5~2.0日と短く、1度に扱える検体数も多く(50個体/1人)、優れた検定法である。
成果の活用面・留意点
  1. この方法は微量の試料で短期間のうちに効率よく検定できるので、繁殖母本や培養幼植物の保毒検定にも適用できる。
  2. 操作はやや煩雑で、技術的な熟練が必要である。普及に移す際は、試験場で研修することが望ましい。
具体的データ
(図1)
(図2)
(図3)
予算区分県単
研究期間1996~1996
研究担当者塩飽邦子
発表論文キクわい化ウイロイド(Chrysanthemum Stunt Viroid)遺伝子のクローニングと全塩基配列、兵庫県農技研報、第44号、1996.ドットブロットハイブリダイゼーションによるキクわい化ウイロイド(Chrysanthmum Stunt Viroid)の検定、関西病虫研報、第38号、1996年.キクわい化ウイロイド感染とわい化症状、関西病虫研報、第38号、1996年.
発行年度1996
収録データベース研究成果情報

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