アグロバクテリウムを利用したキク葉片からの形質転換体の作出効率向上

アグロバクテリウムを利用したキク葉片からの形質転換体の作出効率向上

タイトルアグロバクテリウムを利用したキク葉片からの形質転換体の作出効率向上
要約キク葉片をコルクボーラーで打ち抜き、感染力を高めたアグロバクテリウムに界面活性剤を添加して感染させる。カザミノ酸入り培地で共存培養し、感染処理10日後から抗生物質G418で選抜することで、形質転換体の作出効率が向上する。
担当機関福井県農業試験場 園芸バイテク部 バイテク研究グループ
連絡先0776-54-5100
区分(部会名)北陸農業
専門バイテク
研究対象花き類
分類研究
背景・ねらいキクの形質転換については、国内をはじめ、世界各国で研究されているが、形質転換体の作出効率が低く、安定した技術にはなっていない(500~1000葉片または茎片から1個体の割合で形質転換体を作出)。そこで、形質転換体の作出効率を向上させるため、アグロバクテリウムの感染法と形質転換体(細胞)の選抜方法について、β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を使用して検討する。
成果の内容・特徴
  1. キクへの遺伝子導入効率は、図1の方法を用いることで向上する。
  2. 主な改良点は以下のとおりである。
    ア、葉片の作成はコルクボーラー(直径6mm)を使用する(図1、表1)。
    イ、アグロバクテリウムの感染活性を高めるため、YEP液体培地でアグロバクテリウムの前培養(振とう培養)を5時間行い、菌液を調整する(図1、(表2)。
    ウ、アグロバクテリウムの感染液は、菌液を5倍(OD660=0.1~0.2)に希釈し、感染液が葉片にまんべんなく付着するように、界面活性剤Tween 20を5%添加する。アグロバクテリウムの感染は、キク葉片を感染液に15分間浸漬する(図1、(表3)。
    エ、共存培養は、培地にアグロバクテリウムの栄養源となるカザミノ酸を添加して行う(図1、表4)。
    オ、形質転換体(細胞)の選抜は、感染処理10日後から、抗生物質G418 20mg/lを添加した培地で行う(図1)。培地は2週間毎に更新する。
  3. 本方法により、置床した葉片数に対し4.4%の割合で形質転換体が作出でき、従来の0.1~0.2%に対し20~40倍に向上する(表5)。
成果の活用面・留意点
  1. 品種「秀芳の力」にアグロバクテリウムEHA101:pIG121-Hmを用いたデータである。
  2. 本法は、有用遺伝子を導入する形質転換体の作出に広く活用できる。
具体的データ
図1
表1)
(表2)
(表3)
表4)
(表5)
予算区分国補(地域先端)
研究期間1998~1999
発表論文1.キクにおける安定的なAgrobacterium 形質転換系の確立、平成10年度園芸学会北陸支部研究発表要旨54(1998)
2.キク葉片における安定的なAgrobacterium 形質転換系の確立、福井農試研報35:13-21(1998)
発行年度1998
収録データベース研究成果情報

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