牛凍結精液由来DNAを用いたミトコンドリアDNA多型による個体識別

牛凍結精液由来DNAを用いたミトコンドリアDNA多型による個体識別

タイトル牛凍結精液由来DNAを用いたミトコンドリアDNA多型による個体識別
要約牛凍結精液から調製したDNAには多型解析に充分なコピー数のミトコンドリア(mt)DNAが存在し、このmtDNAの塩基配列の違いおよびPCR-RFLPによってクローン個体間およびドナーとの個体識別を行うことも可能である。
キーワード体細胞核移植、個体識別、ミトコンドリアDNA、凍結精液
担当機関島根畜試 繁殖技術科
連絡先0853-21-2631 / abe-atsuko@pref.shimane.jp / abe-atsuko@pref.shimane.jp
区分(部会名)畜産草地
区分(部会名)近畿中国四国農業
分類科学、参考
背景・ねらい核移植によって作出されたクローン個体間およびドナーは同一の核ゲノムを持っているので、それらの個体間ではミトコンドリアDNA(mtDNA)型判定以外にDNAを用いた個体識別は不可能である。一般に、種雄牛由来DNA材料としては、比較的入手・保存が容易な凍結精液が用いられることも多い。ただし、牛精子細胞中のmtDNAコピー数は極めて少ないことがよく知られており、mtDNA解析の材料としての利用例は殆どみられない。精液をmtDNA多型解析の材料とした場合の手法について、体細胞クローン個体およびそのドナーのDNA材料を用いて検討する。
成果の内容・特徴1.
DNAは、凍結精液をProteinase K 処理後、ゲノムDNA抽出キット(EasyDNAKit,Invitrogen)で調製する。このDNAからmtDNAのD-loop領域中の496bp(15921bp-78bp)をターゲットとしたPCRを行うと、白血球由来DNAと同程度の増幅産物が得られる。よって、凍結精液から調製したDNAには、mtDNAの多型解析を行うために充分なコピー数のmtDNAが存在する。
2.
体細胞クローン種雄牛2頭の凍結精液から調製したDNAを用いて決定したD-loop領域の塩基配列は、ドナー種雄牛の配列とは異なり、個体識別できる(図1)。
3.
また、同じDNA材料を用いて、シークエンシングよりも簡易な方法であるPCR-RFLP(Restriction Fragment
Length Polymorphism)分析で多型が検出できる(図2)ことから、同法を用いれば個体識別がより簡便化される。
成果の活用面・留意点1.
由来レシピエント卵子のmtDNA型が異なる場合では、クローン個体間あるいはドナーとの個体識別が可能である。
2.
D-loop領域多型でmtDNAが判別できない場合でも、他の領域の多型を調査することでmtDNA型を区分できる可能性がある。
3.
由来レシピエント卵子を採取した個体間で母系が同じ場合はmtDNA型が同一であるため、個体識別は不可能である。
4.
塩基置換が認められた部位に制限酵素認識配列がない場合もあるため、その場合にはPCR-SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)などの方法を用いるか、あるいは、シークエンシングによってmtDNA型を判定する必要がある。
具体的データ
図表
図表
予算区分県単
研究期間1998~2007
研究担当者安田康明、安部亜津子、安部茂樹、佐々木恵美、山田彰司、長谷川清寿
発表論文1)安部ら(2002)第9回日本胚移植研究会大会講演要旨集p32
2)安部ら(2003)島根畜試研報36:38-41
発行年度2002
収録データベース研究成果情報

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